时间分辨荧光免疫分析方法学发展历程

时间分辨荧光免疫分析法（Time resolved fluoroisnmunoassay,TRFIA）是上世纪70年代由芬兰的Soini和Hemmia提出的一种新型的检测手段，TRFIA 用稀土离子作为示踪物标记蛋白质、多肽、激素、抗体、核酸探针或生物活性细胞,与其螯合剂、增强液(有一部分不需要) 在待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲和素反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等) 发生特异性亲和反应后,用时间分辨荧光分析仪测定最后产物中的荧光强度,根据荧光强度和相对荧光强度比值,推测反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。TRFIA与化学发光、电化学发光免疫检测技术并称为三大超灵敏检测技术，在食品检测、医学临床检测、环境检测以及生物学科研检测等方面广泛应用。

目前，根据荧光增强技术的不同，TRFIA可分为三种类型：(1)DELFIA (Dissociation enhanced lanthanide fluoroimmunoassay)系统，为芬兰wallac公司（2000年并入美国PerkinElmer公司）于上世纪80年代推出，因其具有非常高灵敏度，目前在国内临床疾病检测领域已有广泛应用；(2)DSLFIA（Direct solid Pahse lanthanide fluoroimmunoassay）系统，为加拿大Cyber Fluor公司推出，但因灵敏度不够理想，目前在国内没有推广；(3)基于荧光微球的TRFIA (Micro-TRFIA)，Micro-TRFIA是一种全新的时间分辨荧光检测手段，它结合了镧族元素荧光的长寿命和纳米微球的信号放大效应，将镧族元素Eu3+及其配合物包裹于纳米微球中，经过表面活化后，将抗体标记于标记物表面，形成复合物，将该复合物用于免疫检测，可极大地提高灵敏度，并获得较为宽阔的线性范围，其实际性能不低于甚至高于DELIFA技术。

    TRFIA的三种类型中前两者因其需要解离后再增强或者需要导入生物素-亲和素信号放大系统，无法与免疫层析技术相结合，仅能与酶标板配合使用，需要多次洗板操作，过程繁复，检测时间长，且需要较为昂贵的荧光读数仪读数，因此目前一般仅限于实验室的检测，无法实现POCT（Point-Of-Care Testing）应用，而Micro-TRFIA技术采用高分子聚合物将几千乃至上万个荧光分子包裹或连接在聚合物纳米粒子中，不但能将荧光信号成千上万倍的放大，满足超低含量生物组分的测定，而且高分子纳米粒子形成的网状外壳对有机染料能起到很好保护作用，可有效减弱测定环境中的活性氧、自由基或其他试剂的光漂白作用，显著提高荧光分子的光稳定性。更为重要的是，Micro-TRFIA技术可以与免疫层析技术（Lateral Flow Immunochromatography Assay）完美结合，开发出荧光定量免疫层析技术平台，实现现场快速定量检测，检测灵敏度比胶体金免疫层析技术高2-3个数量级，因此成为目前国内外研究的新热点。

      微测生物一直致力于基于Micro-TRFIA技术的时间分辨荧光方法学的研发，开发出的Microdetection ^TM系列 时间分辨荧光微球(Time Resolved Fluorescent Microsphere)，每个微球中最多可包裹约18万个荧光分子，大大提高了荧光微球的荧光强度，有效提高了分析灵敏度；同时荧光微球表面修饰有合适密度的羧基或其它功能基团，用于与蛋白或抗体的共价偶联，提高了标记物的稳定性。更为重要的是由于微球包埋的稀土离子已经过了螯合，无需解离增强步骤，因此从根本上解决了传统的DELFIA法只能在液相中而不能在固相界面反应的问题，从而解决了将时间分辨荧光应用于免疫层析平台的技术瓶颈（详情请见微测生物时间分辨荧光免疫层析定量检测平台），在此基础上可开发出灵敏度高于普通胶体金或有色乳胶免疫层析方法1-3个数量级的定量检测技术。同样时间分辨荧光微球也可以用于微孔板超敏定量检测技术平台（详情请见微测生物时间分辨荧光微孔板超敏定量检测技术平台），只需洗涤几次后即可进行荧光测定，操作步骤比DELFIA简单很多，更容易实现自动化操作。